روشهای بیوتکنولوژی اصلاح گیاهان دارویی

کشت بافت

با تکنیک کشت بافت می توان از یک سلول به یک گیاه کامل دست یافت. در این تکنیک از روشهای جنین زایی ریزازدیادی و اندام زایی استفاده میگردد.استفاده از این تکنیک به همراه موتاسیون باعث سرعت بخشیدن به تکثیر انبوه تولید گیاهان عاری از بیماری انجام کار در تمام طول سال و کاهش هزینه خواهد شد.

اولین مرحله تکثیر قسمت مورد نظر در گیاه می باشد.پس از تعیین دز مناسب و انجام تیمار پرتوتابی و تکثیر دوباره گزینش درشرایط In-vitro با اعمال تیمار تنش صورت میگیرد .گیاهان گزینش شده بعد از انتقال به گلدان جهت سازگاری و تکثیر دوباره جهت سلکسیون انتهایی در مزرعه کشت شده و سپس مورد بررسی های تغییرات زنتیکی قرار خواهند گرفت.

یکی از بخش‌های مهم بیوتکنولوژی “کشت بافت” است که کاربردهای مختلف آن در زمینة گیاهان دارویی، از جنبه‌های مختلفی قابل بررسی است:

باززایی در شرایط آزمایشگاهی ( In-Vitro Regeneration )

تکثیر گیاهان در شرایط آزمایشگاهی، روشی بسیار مفید جهت تولید داروهای گیاهی باکیفیت است. روش‌های مختلفی برای تکثیر در آزمایشگاه وجود دارد که از جملة‌ آنها، ریزازدیادی است. ریزازدیادی فواید زیادی نسبت به روش‌های سنتی تکثیر دارد. با ریزازدیادی می‌توان نرخ تکثیر را بالا برد و مواد گیاهی عاری از پاتوژن تولید کرد. گزارش‌های زیادی در ارتباط با بکارگیری تکنیک ” کشت بافت ” جهت تکثیر گیاهان دارویی وجود دارد. با این روش برای ایجاد کلون‌های گیاهی از تیرة لاله در مدت 120 روز بیش از 400 گیاه کوچک همگن و یک شکل گرفته شد که 90 درصد آنها به رشد معمولی خود ادامه دادند.

برای اصلاح گل انگشتانه، از نظر صفات ساختاری، مقدار بیوماس، میزان مواد مؤثره و غیره با مشکلات زیادی مواجه خواهیم شد ولی با تکثیر رویشی این گیاه از راه کشت بافت و سلول، می‌توان بر آن مشکلات غلبه نمود. چنان‌که مؤسسة گیاهان دارویی بوداکالاز در مجارستان از راه کشت بافت و سلول گل انگشتانه موسوم به آکسفورد، توانست پایه‌هایی کاملاٌ همگن و یک شکل از گیاه مذکور به‌دست آورد.

باززایی از طریق جنین‌‌زایی سوماتیک (غیرجنسی)

تولید و توسعة مؤثر جنین‌های سوماتیک، پیش‌نیازی برای تولید گیاهان در سطح تجاری است. جنین‌زایی سوماتیک فرآیندی است که طی آن گروهی از سلول‌ها یا بافت‌های سوماتیک، جنین‌های سوماتیک تشکیل می‌دهند.

این جنین‌ها شبیه جنین‌های زیگوتی (جنین‌های حاصل از لقاح جنسی) هستند و در محیط کشت مناسب می‌توانند به نهال تبدیل شوند. باززایی گیاهان با استفاده از جنین‌زایی سوماتیک از یک سلول، در بسیاری از گونه‌های گیاهان دارویی به اثبات رسیده است. بنابراین در این حالت با توجه به پتانسیل متفاوت سلول‌های مختلف در تولید یک ترکیب دارویی، می‌توان گیاهانی با ویژگی برتر نسبت به گیاه اولیه تولید نمود. حفاظت گونه‌های گیاهان دارویی از طریق نگهداری در سرما با تکیه بر کشت بافت و سلول می‌توان برای نگهداری کالتیوارهای مورد نظر در بانک ژن یا برای نگهداری طولانی مدت اندام‌های تکثیر گیاه در محیط نیتروژن مایع، اقدام نمود. نگهداری در سرما، یک تکنیک مفید جهت حفاظت از کشت‌های سلولی در شرایط آزمایشگاهی است.

در این روش با استفاده از نیتروژن مایع (196- درجه سانتی‌گراد) فرآیند تقسیم سلولی و سایر فرآیندهای متابولیکی و بیوشیمیایی متوقف شده و در نتیجه می‌توان بافت یا سلول گیاهی را مدت زمان بیشتری نگهداری و حفظ نمود. با توجه به اینکه می‌توان از کشت‌های نگهداری شده در سرما، گیاه کامل باززایی کرد، لذا این تکنیک می‌تواند روشی مفید جهت حفاظت از گیاهان دارویی در معرض انقراض باشد. مثلاً بر اساس گزارشات منتشر شده، روش نگهداری در سرما، روشی مؤثر جهت نگهداری کشت‌های سلولی گیاهان دارویی تولیدکنندة آلکالوئید همچون Rauvollfia serpentine , D. lanalta , A. belladonna , Hyoscyamus spp . است.

این تکنیک، می‌تواند جهت نگهداری طیفی از بافت‌های گیاهی چون مریستم‌ها، بساک و دانة گرده، جنین، کالوس و پروتوپلاست به‌کار رود. تنها محدودیت این روش، مشکل دسترسی به نیتروژن مایع است.

تولید متابولیت‌های ثانویه از گیاهان دارویی

از لحاظ تاریخی، اگرچه تکنیک ” کشت بافت ” برای اولین بار، در سال‌های 1940-1939 در مورد گیاهان به‌کار گرفته‌شد، ولی در سال 1956 بود که یک شرکت دارویی در کشور آمریکا ( Pfizer Inc ) اولین پتنت را در مورد تولید متابولیت‌ها با استفاده از کشت توده‌ای سلول‌ها منتشر کرد. کول و استابو (1967) و هبل و همکاران (1968) توانستند مقادیر بیشتری از ترکیبات ویسناجین ( Visnagin ) و دیوسجنین ( Diosgenin ) را با استفاده از کشت بافت نسبت به حالت طبیعی (استخراج از گیاه کامل) به‌‌دست آورند. گیاهان، منبع بسیاری از مواد شیمیایی هستند که به‌عنوان ترکیب دارویی مصرف می‌شوند.

فرآورده‌های حاصل از متابولیسم ثانویه گیاهی ( Secondary Metabolite ) جزو گرانبهاترین ترکیب شیمیایی گیاهی ( Phytochemical ) هستند. با استفاد از کشت بافت می‌توان متابولیت‌های ثانویه را در شرایط آزمایشگاهی تولید نمود. لازم به‌ذکر است که متابولیت‌های ثانویه، دسته‌ای از مواد شامل اسیدهای پیچیده، لاکتون‌ها، فلاونوئیدها و آنتوسیانین‌ها هستند که به‌صورت عصاره یا پودرهای گیاهی در درمان بسیاری از بیماری‌های شایع به‌کار برده می‌شوند.

راهکارهای افزایش متابولیت‌های ثانویه گیاهی از طریق کشت بافت

1- استفاده از محرک‌های (Elicitors) زنده و غیر زنده‌ای که می‌توانند مسیرهای متابولیکی سنتز متابولیت‌های ثانویه را تحت تأثیر قرار داده و میزان تولید آنها را افزایش دهند. لازم به‌ذکر است که این محرک‌ها در شرایط طبیعی نیز بر گیاه تأثیر گذاشته و باعث تولید یک متابولیت خاص می‌شوند.

2- افزودن ترکیب اولیة (Precursor) مناسب به محیط‌کشت، با این دیدگاه که تولید محصول نهایی در نتیجه وجود این ترکیبات در محیط‌کشت، القاء شود.

3- افزایش تولید یک متابولیت ثانویه در اثر ایجاد ژنوتیپ‌های جدیدی که از طریق امتزاج پروتوپلاست یا مهندسی ژنتیک، به‌دست می‌آیند.

4- استفاده از مواد موتاژن جهت ایجاد واریته‌های پربازده.

5- کشت بافت ریشة گیاهان دارویی (ریشه، نسبت به بافت‌های گیاهی دیگر، پتانسیل بیشتری جهت تولید متابولیت‌های ثانویه دارد).

مثال‌های قابل ذکر آنقدر زیاد است که تصور می‌شود هر ماده‌ای با منشاء گیاهی، از جمله، متابولیت‌های ثانویه را می‌توان به‌وسیلة کشت‌های سلولی تولید کرد:

از جمله ترکیباتی که از طریق کشت سلولی و کشت بافت به تولید انبوه رسیده است،‌ داروی ضد سرطان تاکسول است. این دارو که در درمان سرطان‌های سینه و تخمدان به‌کار می‌رود از پوست تنه درخت سرخدار ( Taxus brevilifolia L. ) استخراج می‌گردد. از آنجایی‌که تولید تاکسول به‌دلیل وجود 10 هستة استروئیدی در ساختار شیمیایی آن بسیار مشکل است و جمعیت طبیعی درختان سرخدار نیز برای استخراج این ماده بسیار اندک است، لذا راهکار دیگری را برای تولید تاکسول باید به‌کار گرفت. در حال حاضر، برای تولید تاکسول از تکنیک کشت بافت و کشت قارچ‌هایی که بر روی درخت رشد کرده و تاکسول تولید می‌کنند،‌ استفاده می‌گردد.

سولاسودین ( Solasodine ) نیز از ترکیبات دیگری است که از طریق کشت سوسپانسیون سلولی گیاه Solanum eleganifoliu به‌دست می‌آید. از جمله متابولیت‌های دیگری که از طریق تکنیک کشت بافت و در مقیاس تجاری تولید می‌شود، شیکونین ( Shikonin ) (رنگی با خاصیت ضد حساسیت و ضد باکتری) است. مثال‌های زیر گویای کارایی تکنیک کشت بافت در تولید متابولیت‌های ثانویه است.

تولید آلکالوئید پیرولیزیدین ( Pyrolizidine ) از کشت بافت ریشة Senecio sp ، سفالین ( Cephaelin ) و امتین ( Emetine ) از کشت کالوس Cephaelis ipecacuanha ، آلکالوئید کوئینولین ( Quinoline ) از کشت سوسپانسیون سلولی Cinchona ledgerione و افزایش بیوسنتز آلکالوئیدهای ایندولی با استفاده از کشت سوسپانسیون سلولی گیاه Catharanthus roseus .

استفاده از بیورآکتورها در تولید صنعتی متابولیت‌های ثانویه

تولید متابولیت ثانویة گیاهی با خصوصیات دارویی در شرایط آزمایشگاهی، فواید زیادی در مقایسه با استخراج این ترکیبات از گیاهان، تحت شرایط طبیعی دارد. کنترل دقیق پارامترهای مختلف، سبب می‌شود که کیفیت مواد حاصل در طول زمان تغییر نکند. درحالی که در شرایط طبیعی مرتباٌ تحت تأثیر شرایط آب و هوایی و آفات است.

تحقیقات زیادی در زمینة استفاده از کشت‌های سوسپانسیون و سلول گیاهی برای تولید متابولیت‌های ثانویه صورت گرفته است. از جمله ابزارهایی که برای کشت وسیع سلول‌های گیاهی به‌کار رفته‌اند، بیورآکتورها هستند. بیورآکتورها، مهمترین ابزار در تولید تجاری متابولیت‌های ثانویه از طریق روش‌های بیوتکنولوژیک، محسوب می‌شوند.
مزایای استفاده از بیورآکتورها در کشت انبوه سلول‌های گیاهی عبارتند از:

1- کنترل بهتر و دقیق‌تر شرایط خاص مورد نیاز برای تولید صنعتی ترکیبات فعال زیستی از طریق کشت سوسپانسیون سلولی

2-امکان تثبیت شرایط در طول مراحل مختلف کشت سلولی در بیورآکتور

3-جابجایی و حمل‌ونقل آسان‌تر کشت (مثلاً، برداشتن مایه‌کوبه در این حالت راحت است)

4-با توجه به اینکه در شرایط کشت سوسپانسیون، جذب مواد غذایی به‌وسیلة سلول‌ها افزایش می‌یابد، لذا نرخ تکثیر سلول‌ها زیاد شده و به‌تبع آن میزان محصول (ترکیب فعال زیستی) بیشتر می‌شود.

5-در این حال، گیاهچه‌ها به آسانی تولید و ازدیاد می‌شوند.

سیستم بیورآکتور برای کشت‌های جنین‌زا و ارگانزای چندین گونة گیاهی به‌کار رفته است که از آن‌جمله می‌توان به تولید مقادیر زیادی سانگئینارین ( sanguinarine ) از کشت سوسپانسیون سلولی Papaver somniferum با استفاده از بیورآکتور، اشاره کرد. با توجه به اینکه بیورآکتورها، شرایط بهینه را برای تولید متابولیت‌های ثانویه از سلول‌های گیاهی فراهم می‌آورند، لذا تغییرات زیادی در جهت بهینه‌سازی این سیستم‌ها، برای تولید مواد با ارزش دارویی (با منشأ گیاهی) همچون جینسنوساید (ginsenoside) و شیکونین صورت گرفته است.

نشانگرهای مولکولی

بخش مهم بعدی دارای کاربرد فراوان در حوزة گیاهان دارویی، “نشانگرهای مولکولی” است. قبل از اینکه به موارد کاربرد نشانگرهای مولکولی پرداخته شود، لازم است دلایل لزوم استفاده از نشانگرهای مولکولی در زمینة گیاهان دارویی ذکر شود:

دلایل استفاده از نشانگرهای مولکولی در زمینة گیاهان دارویی فاکتورهایی همچون خاک و‌ شرایط آب و هوایی، بقای یک گونة خاص و همچنین محتوای ترکیب دارویی این گیاه را تحت تأثیر قرار می‌دهند. در چنین حالاتی علاوه بر اینکه بین ژنوتیپ‌های مختلف یک گونه تفاوت دیده می‌شود از لحاظ ترکیب دارویی فعال نیز با هم فرق می‌کنند. در هنگام استفادة تجاری، از این گیاه دو فاکتور، کیفیت نهایی داروی استحصالی از این گیاه را تحت تأثیر قرار می‌دهند:

1-تغییر محتوای یک ترکیب دارویی خاص در گیاه مورد نظر

2-اشتباه گرفتن یک ترکیب دارویی خاص با اثر کمتر که از گیاهان دیگر به‌دست آمده است. به‌جای ترکیب دارویی اصلی که از گیاه اصلی به‌دست می‌آید.

چنین تفاوت‌هایی، مشکلات زیادی را در تعیین و تشخیص گیاهان دارویی خاص، با استفاده از روش‌های سنتی (مرفولوژیکی و میکروسکوپی)، به‌دنبال خواهد داشت. برای روشن‌شدن موضوع به مثال زیر توجه کنید:

کوئینون یک ترکیب دارویی است که از پوست درخت سینکونا ( cinchona ) به‌دست می‌آید. پوست درختان سینکونا که در جلگه‌ها کشت شده‌اند، حاوی کوئیونی است که از لحاظ دارویی فعال است. گونه‌های مشابهی از این درخت وجود دارند که به‌روی تپه‌ها و زمین‌های شیبدار رشد می‌کنند و از لحاظ مرفولوژیکی (شکل ظاهری) مشابه گونه‌هایی هستند که در جلگه‌ها رشد می‌کنند، اما در این گونه‌ها کوئیون فعال وجود ندارد.

در طول دهه‌های گذشته، ابزارهایی که برای استانداردسازی داروهای گیاهی به‌وجود آمده‌اند، شامل ارزیابی ماکروسکوپیک و میکروسکوپیک و همچنین تعیین نیمرخ شیمیایی ( Chemoprofiling ) مواد گیاهی بوده‌اند. قابل ذکر است که نیمرخ شیمیایی، الگوی شیمیایی ویژه‌ای برای یک گیاه است که از تجزیة عصارة‌ آن گیاه به‌وسیلة تکنیک‌هایی چون TLC و HPTLC و HPLC به‌دست آمده است.

ارزیابی ماکروسکوپیک مواد گیاهی نیز بر اساس پارامترهایی چون شکل، اندازه، رنگ، بافت،‌ خصوصیات سطح گیاه، مزه و غیره صورت می‌گیرد. علاوه بر این، بسیاری از تکنیک‌های آنالیز، همچون آنالیز حجمی ( Volumetric Analysis )، کروماتوگرافی گازی (Gas Chromatography )، کروماتوگرافی ستونی ( Column Chromatography ) و روش‌های اسپکتروفتومتریک نیز برای کنترل کیفی و استانداردسازی مواد دارویی گیاهی، مورد استفاده قرار می‌گیرند.

گرچه در روش‌های فوق، اطلاعات زیادی در مورد یک گیاه دارویی و ترکیبات دارویی موجود در آن فراهم آید، ولی مشکلات زیادی نیز به‌همراه دارد. مثلاً برای اینکه یک ترکیب شیمیایی به‌عنوان یک نشانگر ( Marker ) جهت شناسایی یک گیاه دارویی خاص، مورد استفاده قرار گیرد، باید مختص همان‌گونة گیاهی خاص باشد، در حالی‌که همة گیاهان دارویی، دارای یک ترکیب شیمیایی منحصربه‌فرد نیستند. همچنین بین بسیاری از مولکول‌های شیمیایی که به‌عنوان نشانگر و یا ترکیب دارویی خاص مدنظر هستند، هم‌پوشانی معنی‌داری وجود دارد؛ این موضوع در مورد ترکیبات فنولی و استرولی حادتر است.

یکی از عوامل مهم دیگری که استفاده از نیمرخ شیمیایی را محدود می‌سازد، ابهام در داده‌های حاصل از انگشت‌نگاری شیمیایی (Chemical Fingerprinting) است. این ابهام، در اثر تجمع مواد مصنوعی در پروفیل شیمیایی حادث می‌شود. علاوه بر این، فاکتورهای دیگری، پروفیل شیمیایی یک گیاه را تغییر می‌دهند.

که از جمله این فاکتورها می‌توان فاکتورهای درونی چون عوامل ژنتیکی و فاکتورهای برونی چون کشت، برداشت، خشک‌کردن و شرایط انبارداری گیاهان دارویی را ذکر نمود. مطالعات شیموتاکسونومیکی (طبقه‌بندی گیاهان بر اساس ترکیبات شیمیایی موجود در گیاه) که به‌طور معمول در آزمایشگاه‌های مختلف استفاده می‌شوند، تنها می‌توانند به‌عنوان معیار کیفی در مورد متابولیت‌های ثانویه، مورد استفاده قرار می‌گیرند و برای تعیین کمی این ترکیبات، استفاده از نشانگرهای ویژه (شیمیایی) که به‌کمک آن به آسانی بتوان گونه‌های گیاهان دارویی را از یکدیگر تشخیص داد، یک الزام است. در این رابطه، همان‌طور که در فوق ذکر شد، در هرگیاه یک نشانگر منحصر به فرد را نمی‌توان یافت.

مشکلی که در شناسایی گونه‌های گیاهان دارویی با استفاده از صفات مرفولوژیک وجود دارد، وجود نام‌های گیاهشناسی متفاوت در مورد یک گیاه در نواحی مختلف جهان است. در این حالت ممکن است گونه‌های گیاهان دارویی نادر و مفید، با گونه‌های دیگری که از لحاظ مرفولوژیکی به گیاه اصلی شبیه‌اند، اشتباه فرض شوند.

بنابراین، با توجه به مشکلات موجود در زمینة شناسایی گیاهان دارویی با استفاده از روش‌های سنتی و با توجه به پیشرفت محققین در زمینة ایجاد نشانگرهای DNA ‌،‌ استفاده از این تکنیک‌های نوین می‌تواند ابزاری قدرتمند در استفاده کارا از گونه‌های مؤثر دارویی محسوب شود. از جمله مزایای این نشانگرها، عدم وابستگی به سن و شرایط فیزیولوژیکی و محیطی گیاه دارویی است. پروفیلی که از انگشت نگاری DNA یک گیاه دارویی به‌دست می‌آید، کاملاً به همان گونه اختصاص دارد. همچنین برای استخراج DNA به‌عنوان مادة آزمایشی در آزمایشات نشانگرهای مولکولی، علاوه بر بافت تازه، می‌توان از بافت خشک نیز استفاده نمود و از این رو، شکل فیزیکی نمونه برای ارزیابی آن گونه، اهمیت ندارد.

نشانگرهای مختلفی بدین منظور ایجاد شده‌اند که از آن جمله می‌توان به روش‌های مبتنی بر هیبریداسیون (مانند RFLP )، روش‌های مبتنی بر RCR (مانند AFLP ) و روش‌های مبتنی بر توالی‌یابی (مانند ITS ) اشاره کرد.

برخی موارد کاربرد نشانگرهای DNA در زمینة گیاهان دارویی

ارزیابی تنوع ژنتیکی و تعیین ژنوتیپ (Genotyping)

تحقیقات نشان داده است که شرایط جغرافیایی،‌ مواد دارویی فعال گیاهان دارویی را از لحاظ کمی و کیفی، تحت تأثیر قرار می‌دهد. بر پایة تحقیقات انجام شده، عوامل محیطی محل رویش گیاهان دارویی در سه محور زیر بر آنها تاثیر می‌گذارد:

1-تاثیر بر مقدار کل مادة مؤثرة گیاهان دارویی

2-تاثیر بر عناصر تشکیل دهندة مواد مؤثره

3-تاثیر بر مقدار تولید وزن خشک گیاه

عوامل محیطی که تاثیر بسیار عمده‌ای بر کمیت و کیفیت مواد مؤثرة آنها می‌گذارد عبارتنداز نور، درجه حرارت، آبیاری و ارتفاع محل. بنابراین نیاز است که به‌دقت این موضوع مورد بررسی قرار گیرد. به این خاطر، بسیاری از محققین، تأثیر تنوع جغرافیایی بر گیاهان دارویی را از لحاظ تغییرات در سطوح مولکول DNA (ژنتیک) مطالعه نموده‌اند. این برآوردها از تنوع ژنتیکی می‌تواند در طراحی برنامه‌های اصلاحی گیاهان دارویی و همچنین مدیریت و حفاظت از ژرم‌پلاسم آنها به‌کار رود.

شناسایی دقیق گیاهان دارویی

از نشانگرهای DNA می‌توان برای شناسایی دقیق گونه‌های گیاهان دارویی مهم، استفاده کرد. اهمیت استفاده از این نشانگرها، به‌ویژه در مورد گونه‌ها و یا واریته‌هایی که از لحاظ مرفولوژیکی و فیتوشیمیایی به هم شبیهند، دوچندان می‌شود. گاهی ممکن است بر اثر اصلاح گیاهان دارویی کالتیوارهایی به‌وجود آید که هر چند از نظر ظاهر با سایر افراد آن‌گونه تفاوتی ندارد ولی از نظر کمیت و کیفیت مواد مؤثره اختلاف‌های زیادی با آنها داشته باشد.

در این حالت اصلاح‌کنندگان چنین گیاهانی باید تمام مشخصات آن کالتیوار را از نظر خصوصیات مواد مؤثره ارایه دهند که شناسایی و معرفی خصوصیات مذکور مستلزم صرف هزینه و زمان زیاد از نظر کسب اطلاعات گسترده دربارة فرآیندهای متابولیسمی گیاه مربوطه است. به‌علاوه امکان تغییرپذیری وضعیت تولید و تراوش مواد مؤثره در مراحل مختلف رویش گیاه همواره باید مورد نظر اصلاح‌کننده قرار داشته‌باشد.

به‌عنوان مثال، از نشانگرهای RAPD و PBR برای شناسایی دقیق گونة P.ginseng در بین جمعیت‌های جینسنگ ( ginseng ) استفاده شده است. همچنین برخی از محققین از یک راهکار جدید به‌نام DALP ( Direct Amplification of Length Polymorphism ) برای شناسایی دقیق Panax ginseng و Panax quinquefolius استفاده کرده‌اند.

انتخاب کیموتایپ‌های (Chemotypes) مناسب به‌کمک نشانگر

علاوه بر شناسایی دقیق گونه‌ها، پیش‌بینی غلظت مادة شیمیایی فعال گیاهی (Active Phytochemical) نیز برای کنترل کیفی یک گیاه دارویی مهم است . شناسایی نشانگرهای (DNA QTL) که با مقدار آن ترکیب دارویی خاص همبستگی دارند، می‌تواند جهت کنترل کیفی و کمی مواد خام گیاهی، مؤثر واقع شود. لازم به‌ذکر است که تنها تفاوت بین کیموتایپ‌های مختلف، مقدار مادة شیمیایی فعال آنها است.

همچنین، پروفیل‌های حاصل از نشانگرهای DNA می‌توانند جهت تعیین روابط فیلوژنتیکی (خویشاوندی) بین کیموتایپ‌های مختلف یک گونه گیاه دارویی به‌کار روند. در سال‌های اخیر مطالعات زیادی به‌منظور تعیین رابطة بین نشانگرهای DNA و تنوعات کمی وکیفی ترکیبات فعال دارویی در بین گونه‌ها و خویشاوندان نزدیک گیاهان دارویی، صورت گرفته و یا در حال انجام است. از طرفی، به‌کارگیری توأم تکنیک‌های مولکولی و تکنیک‌های آنالیزی دیگر، چون TLC و HPLC ، می‌تواند شناخت ما را نسبت به یک گونة دارویی خاص و به تبع آن کنترل کیفی و کمی ترکیب دارویی مورد نظر در سطح صنعتی، افزایش دهد.

به‌عنوان مثال بررسی تنوع ژنتیکی Artemisia annua ، به‌عنوان منبع ترکیب ضد ملاریای آرتمیزینین (artemisinin)، نشان می‌دهد که ژنوتیپ‌های این گیاه در سراسر هند، از لحاظ محتوای این ترکیب (مقدار مادة مؤثرة آرتمزینین)، تنوع نشان می‌دهند. این بررسی با استفاده از نشانگر RAPD (یک نوع نشانگر DNA ) صورت گرفته است.

مهندسی ژنتیک

شاخة بعدی بیوتکنولوژی که در زمینة گیاهان دارویی کاربردهای فراوانی دارد، “مهندسی ژنتیک” است. پیشرفت‌های اخیر در زمینة ژنتیک گیاهی و تکنولوژی DNA نوترکیب، کمک شایانی به بهبود و تقویت تحقیقات در زمینة بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه کرده است.

قسمت اعظمی از تحقیقات در زمینة متابولیت‌های ثانویه، به‌روی شناسایی و دستکاری ژنتیکی آنزیم‌های دخیل در مسیر متابولیکی سنتز یک متابولیت ثانویه، متمرکز شده‌است. ابزار طبیعی که در فرآیند مهندسی ژنتیک و در اکثر گونه‌های گیاهی و بخصوص گیاهان دولپه به‌کار می‌رود، یک باکتری خاکزی به‌نام آگروباکتریوم (Agrobacterium) است. گونه‌های مختلف این باکتری، مهندسان طبیعی هستند که بیماری‌های‌ تومور گال طوقه‌ (Crown Gall Tumour) و ریشة مویی (Hairy Root) را در گیاهان سبب می‌شوند.

تحقیقات نشان داده‌است که ریشه‌های مویی تولید شده به‌وسیلة گونه‌ای از این باکتری به‌نام‌ A. rhizogenes ‌، بافتی مناسب برای تولید متابولیت ثانویه هستند. به علت پایداری و تولید زیاد این بافت‌ها در شرایط کشت عاری از هورمون، تاکنون گونه‌های دارویی زیادی با استفاده از این باکتری تغییر یافته‌اند. که از آن جمله می‌توان به کشت ریشة‌ مویی گیاه دارویی Artemisia annua به‌منظور تولید ترکیب دارویی فعال، اشاره کرد. تحقیقات نشان داده است که شرایط جغرافیایی،‌ مواد دارویی فعال گیاهان دارویی را از لحاظ کمی و کیفی، تحت تأثیر قرار می‌دهد.

بنابراین می‌توان دید که مهندسی ژنتیک می‌تواند به‌عنوان ابزاری قدرتمند جهت تولید متابولیت‌های ثانویة جدید و همچنین افزایش مقدار متابولیت‌های ثانویه موجود در یک گیاه به‌کار رود.

کشت بافت جانوری

کاربرد روشهای کشت آزمایشگاهی دانشمندان را قادر ساخته است که سلولها ، بافتها و اندامها را از ارگانیسم مادری جدا کرده و آنها را به عنوان واحدهای زیستی ایزوله شده در تحقیقات بعدی مورد بررسی قرار دهند.

یک سلول ، برای اینکه بتواند در محیط کشت سلولی استفاده شود باید دارای قدرت تقسیم خودبخود باشند و این امکان پذیر نیست مگر اینکه منبع کامل و دست نخورده کروموزومی داشته باشند در غیر این صورت نیاز به تحریک محیطی می‌باشد.

تاریخچه

نظریه توتی پتنت بودن همه سلولهای یک ارگانیسم در تئوری سلول مستقر بود. شوان 1839 این فرضیه را مطرح نمود که هر یک از سلولهای زنده موجودات پرسلولی اگر در شرایط محیطی مطلوبی قرار بگیرند باید استعداد تکامل مستقل را داشته باشند. وایت (1954) نخستین کسی بود که مسئله کشت سلولی را به روشنی بیان کرد.

او اظهار داشت که اگر تمام سلولهای یک ارگانیسم ضرورتا مشابه هم بوده و توتی پتنت باشند، تفاوتهای مشاهده شده بین سلولی آن باید به محیط و به سلولهای اطراف یک سلول خاص وابسته باشد. پس با تغییر محیط یک سلول خاص ، می‌توان پتانسیلهای نهفته آن را بیدار کرد.

شرایط محیطی مناسب برای کشت

:1استریل بودن محیط کشت: اغلب میکروارگانیسمها خیلی سریعتر از سلولهای مورد نظر در محیط کشت رشد می‌کنند و در طی رشد خود مواد سمی تولید می‌کنند.

:2لوله‌های کشت و سوبستراها: ثابت شده که سلولهای روی یک سطح با بار منفی به بهترین نحو رشد می‌کنند.

3:محیط کشت و مواد افزودنی: هر محیط کشتی نیاز به یک محلول نمکی نرمال دارد که برای کشت طولانی مدت ، مواد خاص دیگر پایدار افزوده شود.

PH:4محیط کشت: مقدار PH بستگی به محیط گازی کشت دارد.

5:درجه حرارت: هر چه دمای محیط کشت بالاتر باشد، میزان رشد بیشتر است تا اینکه به یک دمایی برسد که از آن بالاتر موجب انهدام سلولی شود.

:6گازهای محیط کشت: مربوط به ترکیب گازی ، بخصوص اکسیژن و دی‌اکسید کربن است.

انواع کشت بافت

کشت مایو آمنیونی یا آمنیوسنتز

در هفته‌های چهاردهم حاملگی و بعد از آن صورت می‌گیرد مقدار حجم مطلوب برای کشت سلولی 20 میلی‌لیتر می‌باشد. بطوری که دو مقدار مساوی 10 میلی‌لیتری از آن برای بالا بردن در صد اطمینان در محیطهای مختلف قرار گیرد. نمونه‌های بدست آمده را به دو قسمت تقسیم کرده بعد سانتریفوژ می‌نمایند. مایع آمنیونی تا 48 - 24 ساعت بعد از نمونه برداری قابل کشت می‌باشد و آن در صورتی است که نمونه در یخچال نگهداری شود. شامل کشت موفق به حجم نمونه ، سن جنین و حالت نمونه (قرمز یا قهوه‌ای) بستگی دارد.
کشتهای بافت توده‌ای

:1پوست: از بیمار ، پوستی به اندازه 1 میلیمتر ضخامت و 4 میلیمتر قطر گرفته، و بعد چربی پوست را برطرف نموده و در محیط شستشو بلافاصله شسته و یک شب در آن غوطه‌ور می‌کنند. نمونه‌های بزرگتر، معمولا از اجساد بدست می‌آید.

2:جنین مرده: نمونه برداری از جنین و یا کیسه جنینی صورت می‌گیرد.

:3نمونه‌های ویلی کوریونی (CVS): در این روش باید دقت کرد که آلودگی سلول مادری در محیط کشت ایجاد نشود.

:4محصولات حاملگی: این واژه در مورد مواد تخلیه شده از رحم بعد از پایان حاملگی اولیه یا به مواد حاصل از سقط خودبخودی بعد از سقط اولیه گفته می‌شود.

کشت لنفوسیت

گزارش اولیه در مورد تقسیم لکوسیتهای خون محیطی در آزمایشگاه به سال 1915 برمی‌گردد. خون محیطی راحت‌ترین بافت قابل دسترسی می‌باشد که برای بررسیهای کروموزومی در تشخیص سندرمهای مختلف استفاده می‌شود و حتی این نوع محیط کشت ، به طراحی نقشه ژنی انسان نیز کمک شایانی کرده است.

کشت سلولهای هیبرید شده

سلولها در صورتی که همراه با ویروس کشته شده سندا یا پلی اتیلن گلیکول کشت شوند باهم آمیزش می‌یابند مثل هیبرید سلول انسان و سلول موش. بخشی از سلولهای ادغام شده تا مرحله آمیزش هسته پیش می‌روند و قسمتی تا مرحله تقسیم سلولی هم پیشرفت می‌کند. به این صورت که هر دو سری از کروموزومها باهم تکثیر می‌یابند و ایجاد یک آمیخته می‌کنند.

در برخی از این آمیخته‌ها ، یک سری از کروموزومها بتدریج از بین می‌روند مثلا کروموزومهای انسان. اما تعدادی از این کروموزومها باقی می‌مانند، که برای باقی ماندن مجبور به نوترکیبی با سری کروموزومی است که باقی می‌ماند. چون درصد سلولهای آمیخته (هیبرید شده) زنده بسیار کم خواهد بود بنابراین به محیطها کشت انتخابی نیاز است که شرایط زیست را برای سلولهای آمیخته فراهم کند.

کشت سلولهای ویژه مثل سلولهای توموری

کشت سلولهای توموری مثل کشت سلولهای برخی بافتهای اختصاصی بدن با اشکالاتی مواجه است. اپجاد یک محیط کشت انتخابی برای سلولهای توموری ، چندان پیشرفت نکرده است چرا که علیرغم رشد سریع توموری در موجود زنده ، این سلولها در محیط آزمایشگاهی چندان رشد نمی‌کنند که این به علت استقلال سلولهای توموری و عدم کنترل تکثیر آنها می‌باشد. اما با این وجود ، توانسته‌اند با ایجاد شرایط تقریبا مساعد غذایی و هورمونی ، ادامه حیات سلولهای توموری را در حد مطلوب یا در حد نگهداری قسمتی از سلولهای کشت شده ممکن سازند.

کاربرد کشت بافت

:1بررسی فعالیت بین سلولی مثل ساخت پروتئین.
:2بررسی فعالیتهای درون سلولی مثل حرکت RNA از هسته به سیتوپلاسم.
:3اکولوژی سلولهای خاص (رابطه موجود زنده با محیط) مثل دگرگونی در اثر عوامل بیماری‌زا.
4:بررسی موارد مرتبط با خود سلول مثل چگونگی چسبندگی به سلولهای دیگر.
:5تهیه واکسنهای ویروسی.
:6تشخیص سرطان.
:7آنالیز ژنتیکی (علم وراثت(
:8بررسی واکنشهای ایمنی مثلا با تولید پروتئینهای مونوکلونال

آموزش علمی کشت بافت به روش خانگی

تکثیر ذره ای، جایگزین مهمی برای شیوه های مرسوم تکثیر گیاه می باشد. این تکثیر، فرآوری گیاهان را از بخش های خیلی کوچک گیاه، در بر می گیرد. تکثیر ذره ای، جایگزین مهمی برای شیوه های مرسوم تکثیر گیاه می باشد. 

یافته های نو در مورد کشت بافت چغندر قند

 چغندرقند یک گیاه دو ساله و دگرگشن است. تکثیر غیر جنسی این گیاه به روش ریزازدیاد کلونی در شرایط درون شیشه موجب دستیابی به یکنواختی بیشتر در اجرای آزمایشهای ترکیب پذیری و نیز حفظ منابع ژنتیکی مورد نیاز برنامه های بهنژادی این گیاه می گردد. تولید جوانه های نا به جا از بافتهای گوناگون امکان پذیر است.

:کشت بافت خربزه

ترکیب محیط های غذایی ( mg/l ) مورد استفاده در کشت بافت خربزه:

 شماره 1: محیط کشت پروتوپلاست، شماره 2: محیط کشت جمع آوری یاخته های حاصل از پروتوپلاست، شماره 3: محیط کشت گیاه زایی یاخته ها، شماره 4: محیط کشت رشد پینه ( کالوس ) و تشکیل جوانه های مناسب، شماره 5: محیط کشت برای واکشت پینه اندام زایی با چندین برابر نوشاخه های خوب تکامل یافته، شماره 6: محیط کشت برای ریشه زایی گیاهچه، شماره 7: محیط کشت برای جوانه زنی بذور خربزه در شرایط ضد عفونی.

آموزش عملی کشت بافت

مقدمه ( گیلاس )

اقلام مورد نیاز برای کشت بافت خانگی

آمایش واسطه ای

ضد عفونی ادوات و دیگر اقلام

ضد عفونی مواد گیاهی

عملیاتی در جعبه های سترون

مقدمه

تکثیر ذره ای، جایگزین مهمی برای شیوه های مرسوم تکثیر گیاه می باشد.

این تکثیر، فرآوری گیاهان را از بخش های خیلی کوچک گیاه، در بر می گیرد ( برای مثال : جوانه ها، گره ها، قطعات برگ، قطعات ریشه، و غیره ) که بطور ضد عفونی شده ( عاری از هر گونه میکروارگانیسم  ) در ظرف کشت، در جایی که محیط و مواد غذایی می توانند کنترل شوند، رشد می کنند. گیاهان حاصله، از نظر ژنتیکی، همانند گیاهان والدین می باشند.

در حالی که در آزمایشگاه تحقیقاتی، همچون آنها در کشاورزی، و علم خاک در UNE، ما تجهیزاتی با فناوری خیلی پیشرفته را به کار می بریم تا به فرآوری گیاه، از طریق کشت بافت دست یابیم. این مهم است که در نظر بگیریم که باغبانان زیادی، و علاقمندان به این کار، می توانند ادوات و تجهیزات با فناوری پیشرفته را با القام معمولی  خانگی جایگزین کنند.

پایلوت کشت بافت گیاهان گرمسیرى و زینتى از طریق کشت بافت

کشت سلول و بافت گیاهى که با عنوانهاى کشت این ویترو و یا کشت استریل نیز مطرح مى شود، ابزارى مهم در مطالعات پایه و کاربردهاى تجارى است. در حال حاضر به عملیاتى نظیر کشت سلولها، بافت ها و اندام هاى استریل و اجزاى آنها تحت شرایط مطلوب فیزیکى و شیمیایى در آزمایشگاه، "کشت بافت گیاهى" اطلاق مى شود.