آموزش عملی کشت بافت

مقدمه ( گیلاس )

اقلام مورد نیاز برای کشت بافت خانگی

آمایش واسطه ای

ضد عفونی ادوات و دیگر اقلام

ضد عفونی مواد گیاهی

عملیاتی در جعبه های سترون

مقدمه

تکثیر ذره ای، جایگزین مهمی برای شیوه های مرسوم تکثیر گیاه می باشد.

این تکثیر، فرآوری گیاهان را از بخش های خیلی کوچک گیاه، در بر می گیرد ( برای مثال : جوانه ها، گره ها، قطعات برگ، قطعات ریشه، و غیره ) که بطور ضد عفونی شده ( عاری از هر گونه میکروارگانیسم  ) در ظرف کشت، در جایی که محیط و مواد غذایی می توانند کنترل شوند، رشد می کنند. گیاهان حاصله، از نظر ژنتیکی، همانند گیاهان والدین می باشند.

در حالی که در آزمایشگاه تحقیقاتی، همچون آنها در کشاورزی، و علم خاک در UNE، ما تجهیزاتی با فناوری خیلی پیشرفته را به کار می بریم تا به فرآوری گیاه، از طریق کشت بافت دست یابیم. این مهم است که در نظر بگیریم که باغبانان زیادی، و علاقمندان به این کار، می توانند ادوات و تجهیزات با فناوری پیشرفته را با القام معمولی  خانگی جایگزین کنند.

اقلام مورد نیاز برای کشت بافت خانگی

1.      یک جعبه ی سترون با هوای راکد، جهت انتقال گیاهان به کار می رود. یک حوض ماهی در یکسوی آن، جعبه ی انتقالی ایده آلی را بوجود می آورد. هر پلاستیک یا محفظه ی شیشه ای، با اندازه های 50 سانتیمتر ( طول )، 40 سانتیمتر ( ارتفاع )، و 40 سانتیمتر ( عمق )، به راحتی می تواند داخل جعبه ی انتقالی ایجاد شوند.

2.      دیگ زودپزی  برای ضدعفونی کردن واسطه ها، ادوات، آب، دستمال کاغذی و غیره.

3.      قالب های شیشه ای ( قالب های غذای کودک عالی می باشند ) و ظروف خوراکی دور ریخته، با سرپوش هایی که نسبت به گرما، درون دیگ های زودپز مقاوم می باشند، ظروف ایده آلی جهت استفاده می باشند.

4.      اسکالپل و پنس

5.      دستمال کاغذی یا حتی کاغذ نسخه ی سفید A4 ، با اندازه های تقلیل یافته، می توانند ضد عفونی ( سترون ) شوند، و برای سطح برش سترونی مورد استفاده قرار گیرند.

6.      یک چراغ الکلی دارای الکل اتیلیک(اتانول)، جهت شعله ور کردن ادوات ( از به کارگیری الکل متیلیک (متانول)، بپرهیزید زیرا که آن سمی می باشد ).

7.      شیشه ی (بطری) افشانک دستی، شامل 70% محلول الکل می باشد تا سوختگاه ( محفظه ) انتقال، و سطوح دیگری می باشد تا اسپری پاشی کنند.

8.      محلول کلر رقیق، 4/1 رقت سفید کننده های خانگی، ( برای مثال:  White King)، برای استفاده در سطوح سترون مواد گیاهی.

9.      هر نوع ضد عفونی کننده ی پوست، برای مثال : Hibitane ( قابل حصول از هر داروخانه ای ).

10. واسطه ها ( به قسمت زیرین نگاه کنید ).

آمایش واسطه ها

همه ی عناصری که در زیر ارائه شده اند، می توانند از سوپرمارکت ها، داروخانه ها و فروشگاههای لوازم بهداشتی، خریداری شوند.

1.      دو فنجان آب باران

2.      یک چهارم فنجان شکر

3.      مایه ی کود شیمیایی: 2/1 قاشق سوپخوری همه منظوره 10:10:10( N.P.K.) کود شیمیایی قابل حل در آب در 1 لیتر از آب: یک فنجان از مایه را برای این دستورالعمل به کار برید.

4.      قرص انوزیتول ( 500 mg ) : 2/1 قرص

5.      قرص ویتامین با تیامین : 2/1 قرص – هر نوع قرص مولتی ویتامینی می تواند استفاده شود.

6.      پولک های ( فلس ها ) آگار : 4 قاشق سوپخوری

این واسطه ی بنیادی ( اساسی ) می باشد. برای آمایش تکثیر و ریشه دهی ( شیار زنی )

واسطه، 2/1 فنجان شیر نارگیل و 2/1 قاشق سوپخوری مالت می افزاید.

شیر نارگیل را با 2/1 فنجان پوره ی گوجه فرنگی سبز یا 2/1 فنجان آب میوه ی تر و تازه جایگزین کنید

 آب پرتقال می تواند واکنش های متفاوتی را ایجاد کند. از این اطمینان حاصل کنید که pH محیط کشت همیشه بین 5 و 6 باشد، تا pH با میزان محدودی را که شاخص اندازه ی pH با میزان وزن خالص باشد را اگر لازم باشد با اسید، برای مثال : اسید سیتریک یا باز، برای مثال : بی کربنات سدیم، به کار برد.

عناصر را در روغن دان ( ماهیتابه ) ترکیب کنید، و به آرامی بجوشانید تا زمانی که آگار حل شده باشد؛ مرتباً آنها را به هم بزنید تا از چسبیدن آگار جلوگیری به عمل آورید و متعاقباً زیر ماهیتابه را به اشتعال در آورید. برای پخش کردن آنها داخل قالب های شیشه ای، از یک ملاقه ( چمچه ) استفاده کنید تا اینکه محیط کشت حدود 2 سانتیمتر عمق پیدا کند.

در یک دیگ زودپزی اختفا کنید و پرورش دهید. به مدت 15 دقیقه پس از اینکه فشاری حاصل شد، بپزید. ( این زمانی حاصل خواهد شد که دریچه ی فشار اجازه ی بیرون آمدن بخار را می دهد ).

ضد عفونی کردن ادوات و اقلام دیگر

پنس و اسکالپل می توانند با شستشو در محلول کلر یا با فرو بردن در الکل یا شعله، ضد عفونی شوند.

آب سترون ( ضد عفونی شده ) برای آبکشی مواد گیاهی و دستمال کاغذی سترون به عنوان یک سطح پاکی که بشود روی آن کار کرد، مورد نیاز می باشند.

کار هایی که با دست انجام می شوند، می توانند روی کاغذ انجام شوند. زمانی که عملیات تمام شد، دستمال کاغی را می شود به دور انداخت، و یک سطح سترون تازه ای را از فرآورده های سفرون بر می گزبنیم. آب را می توان در قالب های شیشه ای سترون کرد. کاغذ ها را در کیسه های کاغذی قرار دهید و آنها را در دیگ زود پز، روی سطوح آبی بپزید.

کیسه، در اتمام عملیات ضد عفونی، مرطوب خواهد شد.

کیسه را به یک دستگاه گرماسازی در 80 درجه ی سانتیگراد منتقل کنید، و به کیسه این امکان را بدهید که داخل کوره خشک شود. کاغذ ها را تا زمانی که مورد نیاز نباشد، باز نکنید.

ضد عفونی کردن مواد ( اجسام ) گیاهی

همه ی مواد گیاهی می توانند در سفید کننده های رقیق خانگی ضد عفونی شوند، برای مثال : White King  ( 4/1 فنجان White King + 4/3 فنجان آب + یک قطره پاک کننده – پاک کننده ای که همچون سورفاکتانت عمل کند ). تکه های گیاهی را در قالب هایی که سفید کننده ها را به مدت 12-10 دقیقه در بر دارند. بارها آنها را به هم بزنید. محلول کلر را به دور بریزید، این عمل باکتری و قارچ و گاهی اوقات برخی اجزای گیاه همچون پولکهای بیرونی و پاجوش های نرم را از بین خواهد برد.

تکه های گیاهی را دو مرتبه با آب سترون شستشو دهید.

عملیاتی در جعبه های سترون

محافظت بیشتری باید انجام شود تا اطمینان حاصل کنید که کشت شما عاری از هر گونه آلودگی ( ناخالصی ) می باشد. برای دست یابی به این، شرح ذیل را انجام دهید :

1.      موهای خودتان را به پشت سرتان گره بزنید، آستین های خود را بالا بزنید و ساعت و هر چیز ارزشمند دیگر را بردارید. ( باز کنید ). دستهای خود را کاملاً با محلول ضد عفونی که مناسب برای استعمال با پوست می باشد، شستشو دهید. اگر به هر شد عفونی کننده ای حساسیت دارید، دستهای خودتان را با آب بشویید و یک رستکش جراحی به دست کنید.

2.      درون جعبه را با افشاندن 70% الکل و با خشک کردن توسط پارجه ی سترونی، ضد عفونی کنید.

3.      کلیه ی اقلامی را که شما در نزدیکی یا درون جعبه نیاز خواهید داشت را جمع آوری و مرتب کنید.

4.      در داخل کابینت عمل کنید و یک تکه ی ضد عفونی شده ای از ساقه را از قالب، با یک جفت پنس بردارید ( مواد گیاهی را با دستتان لمس نکنید ) .

ادوات خودتان را همچنین با فرو بردن آنها در الکل، بین هر دستکاری و مشتعل کردن آنها ضد عفونی ( سترون ) کنید.

تکه های کوچک، دارای 3_2 سانتیمتر طول، و برگهای اندک، می توانند برش یابند، و به محیط کشت آگار منتقل شوند.

اگر برگها خیلی بزرگ بودند، آنها را نیز در اندازه های 2/1- 3/1 برچینید یا ببرید.

یک قطعه ( تکه ) از پاجوش را داخل ظرف کشتی قرار دهید ( مهم است که در این مرحله تنها یک پاجوش در هر ظرف کشت داشته باشیم، برای اینکه اگر پاجوشی آلوده شد، نتواند به پاجوش های دیگر پخش شود ).

دریچه های ظروف کشت را ببندید. قالب ها را در دمای اتاق دور از نور مستقیم خورشید نگه دارید.

تکثیر شاخه :

شاخه ها ممکن است درمرحله قبلی دراز شده باشند پس از گذشت 4 هفته ،آنها نیاز دارند به آماده سازی که انتقال یابند به محیط کشت که حاوی شیر نارگیل برای تکثیر بیشتر است.

تکرار و استریل کردن محیط کشت ،ابزار ها و اتاقک . شما نیز باید از قبل دستهایتان را استریل کرده باشید.

انتقال ظرفهای حاوی شاخه ها به یک طرف کابینت و محیط کشت استریل شده به طرف دیگران

استفاده کردن از پارچه های کاغذی ،پنس و چاقوهایی که قبلا" استریل شده اند.

با یک جفت پنس ، ساقه ها را از ظرفهایشان برداشته و آنها را درسطح پارچه کاغذی استریل شده که مرطوب است قرار دهید.

 این نکته مهم است که همیشه پارچه های کاغذی را مرطوب نگه دارید تا اینکه گیاهان همیشه لطیف و میتوانند به زودی خشک شوند.

شاخه های جدا شده می توانند به شیشه های جدیدی انتقال یابند. در این مرحله حداکثر 5 تکه از گیاهان ممکن است در درون هر ظرف قرار داده شود.

نگه داری کشت هایی که در مرحله قبل توسعه یافته اند . مرحله تکثیر ممکن است تکرار شود. هر 4 هفته تا زمانی که گیاهان کافی بدست آمده باشد.

بطور کلی شاخه ها می توانند تکثیر شوند 3-4 دفعه از هر 4 هفته .

نکته مهم توجه کردن به این نکته است برای جلوگیری از آلودگی در طی این مرحله شما می توانید هوای آلوده را بگیرید زیرا این هوا باعث کاهش بهداشت می شود.

تشکیل ریشه :

زمانی که شماشاخ ها را به اندازه کافی ثابت کردید . شما می توانید اجازه رشد دهید به آنها قبل از آنکه مراحل ریشه دهی شروع شود . شاخه ها به خاطر ریشه دهی به محیط  کشتی که حاوی شیر نارگیل و جوانه جواست انتقال می یابند. حداکثر 5 شاخه در هر ظرف کشت قرار داده می شود. ظرف ها در جایی که قبلا" نگه داری می شدند قرار میگیرند  . ریشه ها بایستس در عرض 2تا 4 هفته تشکیل شوند.

انتقال به آمیخته گلدانی :

عمل مهم در این مرحله انتقال گیاهان به فضای آزاد است .گیاهان ریشه دار شده بصورت زیر نگهداری شوند:

پر کردن گلدانها با آمیخته  گلدانی مناسب بدون هیچ حاصلخیزی وآب کافی و ثابت کردن میزان آبیاری .

انتقال گیاهان ریشه دار شده از محیط کشت آگار با استفاده از یک جفت پنس .

شستشوی آگار ها با آب ولرم به علت وجود ریشه ها .

ایجاد حفره در محیط کشت آمیخته خاکی و قرار دادن ریشه ها درداخل حفره ها به آرامی

اسپری کردن شاخ و برگ با استفاده از اسپری دستی حاوی آب،این گلدانها می توانند درداخل ظروف پلاستیکی بزرگتر با یکپوشش شیشه ای ودور از نور مستقیم آفتاب نگه داری شوند.

زمانی که ریشه ها به اندازه کافی ثابت شدند و سازگاری یافتند . آنها می توانند حاصلخیز شده و پرورش یابند مانند سایر درختان افزایش تدریجی نور نیز برای گیاهان لازم است.

جهش زایی در درون شیشه :

موزهای خوراکی اغلب پلی پلو ئیدهای استریل هستند و باید به طریقه رویشی از دیاد یابند. از جهت اصلاح ژنتیکی با دورگه گیری امکانپذیر نیست . روش جهش زایی پیشنهاد می شود که یک پیشنهاد بسیار عالی برای نزدیک شدن به اصلاح موز می باشد. علاوه بر این ، هتروزیگوت بودن کلون های غیر جنسی موز آنها را برا ایجاد جهش مناسب می سازد. حالت های هتروزیگوتی در مکان های ژنی کولیتوارهای دیپلوئید Aa بوده در صورتی که انواع ژنومیکی تریپلوئید می تواند به شکل Aaa بوجود آید. برای هیبریدها ی برون گونه ای ، اشکال هتروزیگوتی می تواند به صورت AaB  و Aab AAb, ABb, aBb,aBB باشد. ایجاد جهشی ممکن است فنوتیپ مغلوب را توسط تغییر ،باز داشتن یا حذف آلل های غالب مشابه به ظاهر کند . با استفاده از کشت نوک شاخه ها به منظور جهش زایی ، ایجاد جهش و تولید مونانت ها را آسان می کند.

انتخاب بیشتر    60Gy   GN-در مالزی منجر به تشخیص میوه دهی زود رس در موز کاوندیش شده بود که Vovaria نام گرفت. Matsunoto  و Yumagushi موتانت مقاوم به آلومینیوم را که از طریق پرتو افکنی پروتوکروم موز کاوندیش بوجود آمد ه بود انتخاب کردند . Pisang Berangan  یک موزمشهور که میوه دهی ،گلدهی ،رنگ ،بافت گوشتی و اندازه دارد. به هر حال ،این موز نسبتا" گراز بوده و نیز خیلی زود به بیماری پژمردگی فوزارومی دچار می شود و بیماری Freckle (لکه دار شدن ) باعث می شود توسط Clod spurious mesa در نتیجه یک برنامه جهش زایی استفاده ازاعه گاما را برای القاء تنوع ژنتیکی آشنا کرد تا اینکه گیاهان توانستند با یک یا چند صفت گلدهی انتخاب شوند:

تحمل به بیماری Panama

گیاهان پا کوتاه

زود میوه دهی ووزن خوشه ای بالا

اندام زایی توسط کالوس (در بنفشه آفریقایی )

در این روش ، برا ی تکثیر ریز نمونه ها ،کالوس بدست می آید که بعد ها به اندام هایی مانند شاخه و ریشه تبدیل می شوند. تمایز اندام بوسیله نسبت سیتوکنین به اکسین کنترل می شود که این نسبت در کشت بافت خیلی مهم است . میزان کم  هر دو برای  کالوس زایی ضروری می باشد . به هر حال ،اگر سطح سیتوکنین نسبت به سطح اکسین بالا باشد جوانه ها ظاهر می شوند . اغلب جوانه هایی بدست می آیند که بعدا" خودشان بتوانند به آسانی ریشه داده و قلمه چوب نرم تولید نمایند.

بنفشه آفریقایی یک گیاه گلدار خانگی است. این گیاه می تواند به آسانی توسط قلمه تکثیر یابد. همچنین آن می تواند دورن شیشه نیز پرورش یابد. ریزازدیادی یکی از روش های موفقیت آمیز جهت تولید تجاری این گیاه می باشد.

زمانی که گوشوارک یا پهنک برگ روی محیط کشت Skog  وMurashinge قرار می گیرد که حاوی سطوح ویژه ای اکسین و سیتوکنین است.آنها کالوس هایی را تشکیل می دهند که بعد می تواند به اندام ها تمایز یابد. این آزمایشات ،نقش اکسین و سیتوکنین را در تمایز ریشه ها و شاخه ها نشان  می دهد. محیط کشت هفته قبل آماده می شود مگر آنکه شامل تنظیم کننده های رشد گیاهی زیر باشد :

BA 1/0 PPm و NAA 1/0 PPM .

برگهای بنفشه آفریقایی را روی سطح استریل شده ای به مدت 10 دقیقه در ماده پاک کننده کلراکس قرار دهید ،سپس 3 بار در آب استریل شده قرار دهید و بعد از آن تقطیر کنید و در پتری دیش های استریل شده ای برای استفادیتان بگذارید. .ضمنا" موارد زیر را رعایت کنید.

از تکنیک های استریل استفاده کنید و برگها را به پتریدیش استریل شده یتان انتقال دهید.

پهنک برگ را به صورت 6 متر مربع مساوی برش دهید .( 5/1cm * 5/1 cm)

درب شیشه را باز کرده و دوقسمت از برگها و محیط کشت را در درون شیشه قرار دهید و این عمل رابرای شیشه های دوم وسوم نیز تکرار نمایید.

درب را سر جای خود گذاشته و شیشه ها را در برابر هود ترانسفر قرار دهید.

نباید شیشه ها و درب های آنها بر چسب دار باشند.

همه گیاهان را باد در هفته های آینده بتوانید مشاهده کنید.

تکنیک ها ی آلوده در کشت بافت :

در اطرافمان اسپورهای قارچی و سایر میکرو ار گانیسم ها قرار دارند . زمانی که یک اسپور در مجاورت محیط کشت قرار می گیرید ،شرایط برای رشد و جوانه زدن آنها مهیا است . هود های ترانسفر تحت شرایط فشار بالایی عمل می کنند و به فیلترهای هوا ی فوق العاده موثر (HEPA) مجهزند که تقریبا" 3 اینچ ضخامت دارند. فیلتر های HEPA 99/99% در انتقال موادی به اندازه 3/0 میکرول و یا بیشتر موثرند و لی باکتری و اسپورهای قارچی توسط این فیلتر ها شکار می شوند . اگر شما از تکنیک های صحیح جهت کار کردن درون این هود ها استفاده کنید آلودگی کشت های بافت گیاهی واقعا" می تواند حذف شود . نکات زیر در به حداقل رساندن مشکلات کمک خواهد کرد :

ساعت و جواهرات خود را در آورید و دستهایتان را بشوئید.

اسپری کردن زیاد دستها و بازوهایتان با اتانول 70% مهم است.

هر چیزی که وارد هود ترانسفر می شود باید استیل شود. اسپری کردن تک تک  ابزارها ،شیشه ها و سایر ظروف با اتانول 70% مهم باشد.

در موقعیتی قرار گیرید که صورتتان در ارتباط با جریان هود حداکثر دستهایتان را بیرون از هود نگه دارید. برای دسترسی به داخل هود حداکثر بازوهایتان را دراز کنید اما بازوهایتان را روی سطح کار قرار ندهید.

اگر ضروری باشد که سرفه یا عطسه کنید ، لطفا" این کار را به طرف هود انجام ندهید . اگر شما هود را آلوده کنید ،شما ممکن است نابود کنید کشت های همه دانشجویانی که همراه شما هستند . اگر شما بدانید که هود آلوده است ،لطفا" آن را قبل ازاستفاده دیگران تغییر نمایید.

پنس ها ،چاقو ها و سایر ابزار ها را تک به تک روی شعله بگیرید. ابزار ها را در الکل 95% قرار داده و سپس به مدت کوتاهی از روی شعله بگذارید . الکل ها در بار دوم گرما دادن ابزار ها برای استریل کردن آنها ضروری نیست وچاقو ها و پنس های گرم به بافت گیاهی آسیب خواهند رساند.

توجه:پیشنهاد میشود برای مطالعه بیشتر در مورد کشت بافت حتما مجموعه کامل آموزشی کتاب های کشت بافت را دانلود نمایید

دانلود